腺病毒包裝服務
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的DNA病毒，其復制不依賴于宿主細胞的分裂。腺病毒擁有近50個血清型，大多數腺病毒載體都是基于血清型2和血清型5，通過轉基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復制能力。這些重組病毒僅在高水平表達E1基因的細胞中復制，因此是一種適用于治療的高效控制系統。重組腺病毒是進行基因轉移和表達的工具，功能強大并易于操作。腺病毒獨特的生物學特征使它成為“載體的首選”，被科研工作者廣泛使用。
維真生物成立之初，其研發團隊就建成了涵蓋12000多種人源基因的腺病毒庫，具體信息見人源ORF腺病毒。產品自2013年面市后，公司也定制了很多腺病毒包裝項目。目前，維真生物擁有十余年的腺病毒包裝經驗，提供從腺病毒質粒設計、構建、包裝到表達分析的所有服務外包項目。全套的腺病毒載體和表達系統可用于體內外表達多物種ORF、lncRNA、circRNA、shRNA 和CRISPR/gRNA，可滿足客戶多樣化的實驗需求。
下面是具體腺病毒服務內容(具體規格、費用、貨期可詳詢客服)
| 服務編號 | 服務類型 | 規格 | 目錄價 | 貨期 |
|---|---|---|---|---|
| WZ050001 | 小包裝、非純化 | 滴度=1×10E10-11 vp/ml；體積1ml | 詢價 | 詳詢 |
| WZ050002 | 中包裝、純化 | 滴度≥1×10E10 pfu/ml；體積1ml | 詢價 | 詳詢 |
| WZ050003 | 大包裝、純化 | 滴度≥1×10E11 pfu/ml；體積1ml | 詢價 | 詳詢 |
*如您對上述服務感興趣，請您點擊“歡迎垂詢”留下您的信息，我們將為您提供具體實驗方案和項目價格。
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↓↓ 分以下幾個部分做詳細介紹 ↓↓ |
腺病毒是一種直徑為90-100nm的病毒顆粒，衣殼呈廿面體，由240個六鄰體和12個五鄰體組成。以五鄰體蛋白為基底由衣殼表面伸出12根纖毛，纖毛頂端形成頭節區。五鄰體和纖毛的頭節區可與細胞表面的受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。右面是腺病毒的結構示意圖：
腺病毒是一種雙鏈線性的DNA病毒，其基因組長度約為36kb。基因組兩端各有一個103 bp的反向末端重復序列(inverted terminal repeat, ITR)，參與病毒DNA的復制；ITR的內側為病毒包裝信號Ψ，參與腺病毒基因組的衣殼化。基因組包含早期表達的與腺病毒復制相關的E1~E4基因和晚期表達的與腺病毒顆粒組裝相關的L1~L5基因。下圖是人類血清5型腺病毒基因組的示意圖：
基于人血清5型腺病毒的基因組結構，結合各基因的功能，科學家們開發了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒載體。E1基因在組裝感染性病毒顆粒時必不可少，但是可以在HEK293包裝細胞中得到補充，而E3基因不影病毒的包裝。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒載體可插入高達7.5kb的外源基因。
腺病毒感染細胞的第一步是通過纖突蛋白與細胞表面CAR結合。腺病毒粘附后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸（RGD）與細胞表面的整合素αvβ3和αvβ5結合并相互作用使腺病毒進入細胞。下圖是腺病毒感染細胞的示意圖：
1、腺病毒感染的宿主細胞范圍廣，包括分裂細胞和不分裂細胞（某些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞除外）。
2、腺病毒感染效率高，在最佳感染條件下，感染率可達100%。
3、腺病毒的病毒滴度可以很高，純化、濃縮后可達1012-13vp/ml（即1010-11pfu/ml）。
4、腺病毒易于擴增，而其他病毒比如慢病毒和腺相關病毒需要重新包裝。
5、不整合到染色體中，無插入致突變性。
6、腺病毒理化性質穩定，4℃：數周。-80 ℃：數年。
Ad5腺病毒的高效感染依賴于靶細胞膜上的CAR和αvβ整合素，但是一些免疫細胞的細胞膜上卻缺乏這些受體，如造血干細胞。這就使得研究人員尋找新的腺病毒血清型，最終發現F35血清型對造血干細胞有很強的靶向性，因此，嵌合型Ad5/F35應用而生。下面是Ad5 & Ad5/F35的結構示意圖和區別：
| 腺病毒種類 | 載體特點 | 功能 | 感染細胞受體 | 包裝系統 |
|---|---|---|---|---|
| AdV5 | 缺失E1和E3基因，允許插入長約8kb的外源基因 |
除免疫、血液類細胞外， 感染大部分細胞 |
CAR | AdMax |
| AdV5/F35 | 一個嵌合型腺病毒載體，主要結構是在AdV5的基礎上，其受體結合位置的纖突(Fiber)改造成了F35型腺病毒(F35)的纖突(纖毛蛋白的Knob和shaft)。其細胞受體從AdV5的CAR變成了CD46，其他的基因仍舊保留AdV5載體的特性，能有效轉導CAR表達不足的多種重要靶細胞，尤其是對腫瘤細胞及造型干細胞、間充質干細胞等有較高的感染效率。 | 理論上感染所有有細胞核的細胞 | CD46 | AdMax |
維真生物采用的包裝系統包括了AdEasy和AdMax系統。其中，AdMax系統操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產率也高，故成為目前腺病毒包裝主要采用的系統。下圖是AdEasy和AdMax系統的示意圖：
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| AdEasy系統 |
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| AdMax系統 |
維真生物可以提供從腺病毒（AdV）質粒設計、構建、包裝到表達分析的所有服務外包項目。而且，維真生物全套的腺病毒載體和表達系統可用于體內和體外表達human/mouse/rat ORFs，lncRNA，circRNA，shRNAs和CRISPR/gRNA。維真生物生產的腺病毒具有滴度高、純度高和穩定性高的三高優點。下面是腺病毒從頭合成的流程：
維真生物采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對AdV病毒進行純化。碘克沙醇是一種造影劑，已接受了臨床檢驗。它具有非離子型、對細胞無毒和代謝惰性等優點。現在在病毒純化方面應用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶。下圖是AdV病毒純化后的示意圖：
維真生物的AdV病毒采用多種方法來定量，主要包括QPCR法、孔稀釋法和快速腺病毒滴度免疫檢測法。下表是各方法的詳情：
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滴度標定法 |
原理 |
滴度單位 |
用途 |
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QPCR法 |
用腺病毒基因組特異性引物進行QPCR。在定量曲線的線性范圍內，Ct值與已知拷貝數質粒Ct值的比值，即為病毒基因組的初始拷貝數 |
vp/ml |
預制腺病毒庫中 |
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孔稀釋法 |
數熒光 |
pfu/ml |
帶熒光腺病毒的 |
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免疫法 |
通過抗腺病毒抗體與感染了腺病毒供試樣品的細胞結合，再用辣根過氧化物酶標記的二抗與一抗結合，經顯色液顯色，被感染的細胞顯示出明顯的棕色，通過計數及計算，測定腺病毒滴度 |
pfu/ml |
該方法不受熒光限制，適用于所有腺病毒滴度的測定 |
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1. 載體全： |
多種表達載體、多種標簽載體和多種報告基因可供客戶選擇。 |
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2. 貨期短： |
Human ORF cDNA克隆可在2-3天穿梭至其他標簽（3×Flag，Myc，Flag，HA，6×His，Flag & His，GFP，RFP等）的穿梭載體，個性化定做腺病毒； |
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3. 純度高： |
采用改良的碘克砂醇密度梯度超速離心法進行腺病毒純化，對于動物沒有任何毒性； |
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4. 服務優： |
可根據客戶具體實驗，由公司專業技術人員提供載體構建方案，提供特殊定制服務。 |
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1. 您好，我感染的細胞是滋養層細胞，感染之前在六孔板中接種十萬細胞，貼壁16h后加加入病毒（MOI=40），30h后細胞長滿。我想咨詢：病毒感染后實驗組跟對照組相比細胞生產差不多，正常嗎？
如果感染腺病毒的細胞狀態與未感染組的細胞狀態無明顯差異，說明該病毒對細胞沒有明顯毒性作用。因此，未必是病毒數量不夠。非腺病毒包裝細胞被腺病毒感染后是不會有什么明顯的特征。如果您在加入病毒的時候是提前把病毒用培養基稀釋混勻之后再加入培養皿中的，那么高MOI值（導致細胞飄起來）對于目的細胞是比較高的。因此，您不用擔心，可以先檢測一下是否有蛋白表達。
2. 腺病毒感染細胞后是否需要更換新鮮培養液？
是否需要更換新鮮培養液需要看加入病毒的量，病毒量多的時候會對細胞有毒性：如果鏡檢時看到細胞狀態有變化，需要在4-8h左右更換新鮮培養液；如果鏡檢時看到細胞狀態無明顯變化，那么病毒感染細胞之后就無需更換新鮮培養液。或者，如果您擔心病毒長時間作用于細胞會有毒性，也可在12h后更換新鮮培養液。
3. 腺病毒感染細胞4-6h之后發現細胞全部飄起來了，請問這是怎么回事？
造成上述現象的原因主要有三點：
1）細胞的狀態：感染之前鋪板的細胞一定要使用健康的細胞；
2）實驗操作不當：在加入病毒液的時候，如果局部病毒濃度過高會導致細胞死亡。因此，我們建議將病毒和培養基混勻之后再加入細胞中。
3）如果以上2點均無誤，那就是加入的病毒量太大了。
4. 腺病毒感染細胞時，加入病毒量的依據是什么？
要得到最佳實驗結果，確定腺病毒的最適用量是關鍵。量不足達不到100%感染效率；量太高則會對細胞產生毒性。那么如何確定呢？"感染復數"(MOI，multiplicity of infection)起著決定作用。MOI是是感染時病毒與細胞數量的比值。不同細胞系細胞表面的腺病毒受體數量不同，這就決定了不同細胞系的MOI會有所不同。通常，易感染細胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是，對于某些難感染的細胞系，MOI可能需要高達1000。對于大多數細胞系來說，最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻或者在正式實驗前，在目的細胞中用報告基因的腺病毒進行預實驗摸最佳MOI。
最適病毒用量的計算公式：
病毒用量pfu=最佳MOI×細胞數目/病毒滴度
例如, 如果您目的細胞的最佳MOI=10，您需要感染106的細胞，那么您共計需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度為1×1010 pfu/mL, 那么您實驗需要的病毒量就是1ul.
5. 腺病毒感染細胞之后多久可以從基因水平和蛋白水平檢測表達？如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時間是否有區別？
腺病毒攜帶的目的基因表達快。如果您想從基因水平檢測基因的表達，那么在病毒感染細胞12-24h之間進行檢測；如果您想從蛋白水平檢測基因的表達，那么在病毒感染細胞48-72h之間進行檢測。
對于分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時間一樣。如果擔心蛋白分泌出來，也可以將培養基也一起帶著做western blot。
6. 腺病毒毒種被細菌污染了，沒有多余毒種，也沒有構建好的載體，怎么辦？
因為腺病毒的直徑大小是90-100nm，而細菌的直徑大小要大的多，可以用22um的濾器進行過慮。如果您的病毒量很低，擔心過慮后損失太多，無法進行后面的擴增工作，您可以先用污染了細菌的腺病毒直接擴增，當然擴增的結果是得到了污染了細菌的腺病毒，但病毒的量會提高一些，這樣再用22um的濾器進行過濾。
7. 如何鑒定腺病毒遞送的目的基因？
可以按照如下方法進行鑒定：
①針對基因設計引物，同時作為擴增和測序引物；
②將病毒用蛋白酶K處理后做為模板，如果是未純化的病毒還需要過純化柱處理掉培養基的成分；
③以處理過的病毒為模板進行PCR；
④用PCR引物對PCR產物測序。
8. 慢病毒、腺病毒、腺相關病毒三種病毒有什么區別？如何選擇？
對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：
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病毒表達系統 |
腺病毒 |
腺相關病毒 |
慢病毒 |
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病毒基因組 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA |
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病毒外殼 |
無 |
無 |
具有包膜蛋白 |
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基因組大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
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包裝容量 |
7.5kb |
4.7kb |
6kb |
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感染的細胞類型 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
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整合至宿主基因組 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
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表達豐度 |
高水平表達 |
高水平表達 |
中到高水平表達 |
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表達時間 |
快（1-2天） |
1-2周（體內） |
慢（2-4天） |
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外源基因持續表達時間 |
短暫 |
潛在的持久 |
長久 |
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免疫反應 |
較高 |
極低 |
低 |
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相對病毒滴度 |
10E10pfu/mL |
10E13VG/mL |
10E8TU/mL |
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生物安全等級 |
BSL-2 |
BSL-2 |
BSL-2 |
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ORF現貨腺病毒：
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1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
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8. |
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9. |
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10. |
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11. |
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12. |
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13. |
MicroRNA現貨腺病毒：
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1. |
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2. |
基因過表達方面：
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1. |
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2. |
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3. |
J Cell Physiol. (IF=5.546) . Wang M, et al. (2021) . Lack of Mof reduces acute liver injury by enhancingtranscriptional activation of Igf1. [過表達/干擾 急性肝損傷] |
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4. |
Front Cell Dev Biol. (IF=5.201) . Gu J, et al. (2021) . CFTR Deficiency Affects Glucose Homeostasis via Regulating GLUT4 Plasma Membrane Transportation. [過表達 成肌細胞] |
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5. |
Front Immunol. (IF=5.085) . Wu L, et al. (2021) . EZH2 Inhibition Interferes With the Activation of Type I Interferon Signaling Pathway and Ameliorates Lupus Nephritis in NZB/NZW F1 Mice. [過表達 狼瘡腎炎] |
|
|
6. |
[4]Oxid Med Cell Longev. (IF=5.076) . Gao Y, et al. (2021) .Rap1GAP Mediates Angiotensin II-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy by Inhibiting Autophagy and Increasing Oxidative Stress. [過表達 心肌] |
|
|
7. |
J Cell Mol Med. (IF=4.486) . Lei W，et al. (2021) . MARCH5 restores endothelial cell function against ischaemic/hypoxia injury via Akt/eNOS pathway. [過表達 心肌] |
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8. |
J Biol Chem. (IF=4.238) . Zhang Z，et al. (2021) . The adaptor protein GIPC1 stabilizes the scavenger receptor SR-B1 and increases its cholesterol uptake. [過表達/干擾 肝臟] |
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|
9. |
J Anim Sci Biotechnol. (IF=4.167) . Liu J, et al. (2021) . Comprehensive evaluation of the metabolic effects of porcine CRTC3 overexpression on subcutaneous adipocytes with metabolomic and transcriptomic analyses. [過表達 脂肪細胞] |
|
|
10. |
Aging. (IF=4.831) .Chen Y, et al. (2020). Mitophagy impairment is involved in sevoflurane-induced cognitive dysfunction in aged rats[自噬雙標 術后認知功能障礙]. |
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11. |
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14. |
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16. |
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18. |
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20. |
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23. |
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24. |
基因沉默方面：
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1. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
基因編輯方面：
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1. |
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2. |
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3. |
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service@wzbio.cn
