shRNA克隆
研究基因的功能，科研工作者通常從兩方面著手：功能獲得性和功能喪失性。而RNAi技術就是功能喪失性研究的一種。它是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA（dsRNA）時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。它是研究轉錄后調控的有效工具，可用于功能基因組研究以及基因治療等臨床應用。
維真生物擁有十余年包裝經驗，為了靈活滿足研究者不同科研項目的需求，可提供多種shRNA克隆服務，服務內容見下面：(具體規格、費用、貨期請詳詢客服)
| 服務編號 | 服務類型 | 規格 | 目錄價 | 貨期 |
|---|---|---|---|---|
| WZ030001 | 單shRNA質粒構建 | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ030002 | 套餐shRNA質粒構建(3保1) | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 |
咨詢 |
| WZ030003 | 套餐shRNA質粒構建(4保1) | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ030004 | 2 in 1 shRNA質粒構建 | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ030005 | 3 in 1 shRNA質粒構建 | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ030006 | 4 in 1 shRNA質粒構建 | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ030007 | 誘導性shRNA質粒構建(Dox、Cre……) | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
| WZ020008 | mir30-based shRNA質粒構建 | 5ug質粒+500ul菌液 | 詢價 | 咨詢 |
現貨產品： 9大現貨質粒庫 人源shRNA克隆 病毒包裝載體 病毒表達載體 輔助試劑
相關服務： 分子克隆 定點突變 shRNA克隆服務 腺病毒包裝 慢病毒包裝 腺相關病毒包裝 CRISPR shRNA&gRNA序列篩選 KO/敲入/穩定細胞系建立
技術資料： 病毒的制備和使用 客戶文章 知識分享 四種病毒的區別
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↓↓ 分以下幾個部分做詳細介紹 ↓↓ |
近年來，RNAi已成為研究基因功能不可或缺的工具。其應用領域已經從基因組學研究逐步擴展到醫學領域并作為基因治療手段。RNAi作為這么重要的分子生物學技術，其原理如何？如下圖所示：外源dsRNA進入細胞后在Dicer酶的作用下產生雙鏈siRNA，雙鏈siRNA解旋后，其反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有結合和切割mRNA的作用，從而介導RNA干擾的過程。
根據RNAi的作用機制，RNAi實驗的研究步驟大體分為4步，詳見下圖：
除了化學合成siRNAs外，維真生物可以提供Vector-based shRNAs構建、導入細胞和抑制效果驗證服務，功能驗證服務需要根據客戶的實驗需求進行現場評估。RNAi的效應分子是siRNA。不管您選擇什么干擾方式，最終均會形成siRNA，然后與RISC多蛋白復合物組裝成有活性的RISC，發揮基因沉默功能。*shRNA(short hairpin RNA)，即短發卡RNA，是可以克隆至表達載體并表達siRNA雙鏈的RNA分子；siRNA(small interfering RNA)，即小干擾RNA，是21-23nt的雙鏈RNA復合物，每條鏈的3’端有2-3個突出的非配對堿基且3’端為羥基，5’端為磷酸，這個結構具有能被Rnase Ⅲ樣活性的核酸酶識別切割的特征，從而引發高度保守的Dicer 家族的RNaseⅢ的識別作用進而特異切割dsRNA產生基因沉默作用。下面是siRNA(上圖)和shRNA(下圖)的結構示意圖：
siRNA與shRNA都可以有效沉默或抑制目標基因的表達，但是作用機制還是有一些區別的，具體內容詳見下圖：
| 比較項 | shRNA | siRNA |
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| 穩定性 | 高 | 低、容易降解，壽命短 |
| 作用時效 | 作用時間較長，持續數星期甚至更長 | 作用時間較短，一般為1周左右 |
| 脫靶率 | 低 | 高 |
| 導入細胞方式 | 質粒載體，普通轉染；病毒導入，克服轉染困難細胞的導入； | 普通轉染；轉染困難細胞的細胞難轉染 |
| 表達方式 | 聚合酶II型和III型啟動子驅動；可使用誘導表達系統； 可以與報告基因共表達，可視化細胞導入效率 | 直接化學合成 |
| 抑制效果檢測時間 | 取決于靶蛋白的半衰期 | |
4in1 shRNA克隆案例分享胃癌是侵襲性極強的惡性腫瘤之一，早期診斷率低，轉移率高。盡管胃癌在治療方面已經取得了一定的進展，但為了尋求更佳的治療手段，需要更好地了解其潛在發病機制和新的治療靶點。驅動蛋白超家族23基因（KIF23），在細胞質分離、軸突生長等多種細胞過程中發揮重要作用。目前，KIF23已被發現在多種腫瘤組織和細胞中高表達，提示KIF23與腫瘤發生有潛在的聯系。在本篇研究，作者發現KIF23的表達與胃癌的不良預后相關，且與腫瘤分期（pTNM）有關。體外實驗證明，KIF23的缺失對胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用。此外，KIF23基因敲除可顯著抑制小鼠胃癌細胞的增殖，并顯著下調腫瘤細胞增殖因子Ki67和PCNA的表達。綜上所述，這些數據表明KIF23可能是胃癌的一個潛在治療靶點。
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shRNA腺病毒案例分享據報道，跨膜蛋白173（TMEM173）重組蛋白能參與內質網應激、炎癥和免疫過程，這些過程都與心肌肥大密切相關。TMEM173和自噬之間有密切而復雜的聯系，但它在自噬中的具體作用還有待進一步研究。在本文中，作者發現與野生型C57BL/6小鼠相比，Tmem173基因敲除（KO）的小鼠在橫向主動脈縮窄（TAC）6周后表現出更嚴重的肥大、纖維化、炎性浸潤和心臟功能障礙。透射電鏡和蛋白質水平顯示KO小鼠心肌自噬小體降解受到抑制。另外，苯腎上腺素處理的乳鼠心肌細胞的體外實驗表明，Tmem173基因的豐度與Lc3-Ⅱ的豐度和反映自噬體降解能力的紅色和黃色熒光點數呈負相關。這些結果表明，TMEM173可以改善自噬通量，并對壓力超負荷所致的心肌肥厚具有保護作用，暗示其可能成為未來治療心肌肥厚的潛在靶點。
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4in1 shRNA腺病毒案例分享破骨細胞是從單核/巨噬細胞系分化來的多核細胞，受核因子-κB受體激活因子配體( RANKL)調控，行使骨吸收的功能。過度的骨吸收會導致骨轉換失衡，并引發各種骨疾病。因此，探索破骨細胞骨吸收的新靶點或機制，可能有助于提高破骨細胞引起的骨疾病的治療效果，減少疾病副作用。先前研究已證明RANKL誘導的破骨細胞形成過程中，糖酵解代謝增強，但其發揮的具體作用尚不清楚。6-磷酸果糖-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3 (PFKFB3)，是糖酵解的重要調節因子，華中科技大學同濟醫學院的研究人員通過對PFKFB3進行遺傳和藥理抑制，并利用去卵巢小鼠模型研究了PFKFB3在破骨細胞分化中及破骨細胞相關疾病發病機制中的作用，揭示了靶向PFKFB3阻斷糖酵解是一種潛在的治療破骨細胞相關疾病的策略。
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4in1 shRNA慢病毒案例分享雄激素受體AR在前列腺癌的發展和惡化中至關重要，通過前期研究作者發現，去泛素化酶-泛素特異性蛋白酶14（USP14）可以通過其去泛素化酶的活性穩定AR，促進前列腺癌的生長。近期，研究人員發現，AR在乳腺癌的發生發展中也能發揮關鍵作用。本篇文章主要探究去泛素化酶USP14對雄激素受體陽性乳腺癌發生發展的影響，該研究結果對當下以USP14為靶標治療AR乳腺癌新策略的觀點進行了有力支持。 研究者通過shRNA慢病毒，敲低USP14的表達，然后檢測雄激素受體AR的表達，泛素化水平和降解速率，判定USP14是雄激素受體AR的去泛素化酶，穩定AR的水平，并通過進一步的的AR補救實驗判定USP14敲低或者抑制引起的乳腺癌細胞的生長抑制依賴于AR的水平。
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mir30-based shRNA AAV案例分享恐懼和壓抑等情緒是我們生活中的正常生理和心理反應，但長期頻繁的急性情緒反應（又稱慢性應激）不僅會使腦神經可塑性發生變化，增加抑郁和焦慮風險，還會引起外周血T淋巴細胞功能障礙，造成免疫系統紊亂。目前的研究已經發現了多種免疫因子在心理疾病中的生理功能，然而，外周血T淋巴細胞在慢性應激誘導焦慮中的作用及其調控機制仍有待探索。浙江大學和東南大學研究團隊在《CELL》聯合發文，揭示了CD4+ T細胞嘌呤合成代謝紊亂與慢性應激誘導的焦慮行為之間的相互關聯，該成果對加深神經發育、精神疾病與免疫生理功能之間聯系的理解，對了解抑郁癥和焦慮癥的發病機制并開發新的治療藥物具有重要意義。 
流式細胞術分析顯示AAV病毒在左杏仁核少突膠質細胞中強烈、特異性表達 |
誘導性shRNA AAV案例分享抑郁癥是一種慢性復發性疾病，患病率呈逐年上升的趨勢，已成為世界疾病排行榜的第四大疾病。研究表明，炎癥和抑郁癥發生密切相關，長期精神壓力應激會使伏隔核(NAc)腦區緊密連接蛋白Cldn5（血腦屏障BBB的關鍵組分）表達下調，導致血腦屏障受損并促進抑郁樣行為。然而，血腦屏障損害為何僅出現在NAc，應激易感小鼠NAc腦區中緊密連接蛋白表達下調的分子機制尚不清楚。 
伏隔核神經元cAMP調控血腦屏障完整性和抑郁敏感性 中國藥科大學的研究人員通過代謝組學分析等手段對壓力應激誘導抑郁的小鼠模型進行研究，發現cAMP在NAC中特異性降低，并與抑郁程度呈正相關，在NAC中補充cAMP可以改善BBB的完整性和抑郁樣行為。RNA-Seq分析發現，cAMP下降主要是因為其合成酶Adcy5受抑制，且此過程只發生在神經元細胞中。通過降低NAc中Adcy5的表達，內源性調節神經元內cAMP合成，可調節對社會應激的敏感性。此外，NAc腦區cAMP不足降低了胞外基質蛋白reelin的表達，外源補充后促進了BBB完整性，并改善了抑郁樣行為。上述結果表明，神經元cAMP可能通過Reelin介導的細胞外基質信號調節NAC血腦屏障完整性的分子機制，為抑郁癥的防治提供了新思路。
伏隔核內神經元CAMP合成內源性調節后的行為變化 |
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關于Vector-based shRNAs，為了滿足廣大科研工作者不同的實驗需求，維真生物可以提供多種shRNA質粒構建服務：
單個shRNA載體構建，客戶提供高效siRNA靶點，維真生物公司根據靶點構建shRNA質粒。
套餐shRNA質粒構建，維真生物根據客戶提供的靶基因信息構建3保1或者4保1 shRNA質粒。
多和1 shRNA載體構建特色1，維真生物根據客戶提供的高效siRNA靶點和靶基因信息構建多和1 shRNA質粒。
以4 in 1 shRNA為例：該服務是將4條shRNA序列克隆至1個shRNA質粒。維真生物的4 in 1 shRNA質粒不僅可以用于轉染細胞，也可包裝成病毒用于病毒導入宿主。
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| 4 in 1 shRNA下調GFP表達 |
4 in 1 shRNA下調RCAN1表達 |
1）將4個作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆進同一shRNA載體，增加了目的基因下調表達的概率。
2）將高效的、作用于2-4個靶基因的shRNA序列克隆進同一shRNA載體，實現2-4個基因同時下調表達的目的。
3）無需序列篩選，大大減少實驗工作量。
4）多種4 in 1 shRNA病毒載體的選擇，包括腺病毒穿梭載體、慢病毒載體和腺相關病毒載體，實現不同的實驗目的。
針對同一目的基因的4條shRNA序列，不能具體確定哪條shRNA序列的干擾效果最好。
mir30-based shRNA質粒構建特色2，實現組織特異性基因沉默。
shRNA的RNAi機制與microRNA成熟機制一樣，因此，shRNA也可以由聚合酶II型啟動子驅動表達。這類啟動子包括廣譜啟動子(如CMV、CAG和EF1a等)和組織特異性啟動子(如hSyn、TBG和cTnT等)，可以啟動較大的基因轉錄，且需要polyA等轉錄終止信號。維真生物可以根據客戶指定的啟動子和提供的shRNA序列將其構建至mir30-based shRNA質粒。mir30-based shRNA結構示意圖如下：
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誘導性shRNA質粒構建特色3，包括Cre/loxp，Flp/Frt和Tet on等誘導系統。
以Cre on shRNA為例，該服務是使用FLEX(flip-excision)系統實現shRNA誘導表達。FLEX是一種非常強大的控制基因表達的方法，它采用2對異質、反向的loxp位點(loxP和lox2272)，經過DNA翻轉產生帶有不同loxp位點的DNA翻轉，防止進一步的DNA翻轉，實現目標基因不可逆的翻轉。維真生物采用改良版FLEX，將2對異質、反向的loxp位點置于啟動子兩邊，通過cre作用決定啟動子方向，通過不同熒光蛋白可視化shRNA的表達。
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1. 維真生物載體的啟動子是哪些？
維真生物載體使用兩類啟動子：人源的U6啟動子和H1啟動子。
2. 人源的U6啟動子和H1啟動子是否可以應用于大鼠、小鼠或其他哺乳動物細胞中？
可以的。人源的U6啟動子和H1啟動子之間沒有物種差別。這些啟動子在大鼠、小鼠或其他哺乳動物細胞中的啟動效率也非常好。
3. 你們保證siRNA干擾載體的效果嗎？
如果針對一條被干擾的基因設計三條或四條shRNA，維真生物承諾在客戶細胞轉染效率達80%以上的條件下，如果3個或者4個靶點shRNA沒有任何一個對靶基因的抑制效率在mRNA水平上達到70%以上，公司將免費重新設計并構建4個新的shRNA質粒，需要增加一個實驗周期。若重新構建的shRNA載體仍然沒有任何一個對靶基因mRNA的抑制效率能夠達到70%，可能和該基因有關，公司僅收取客戶單次shRNA載體構建費用。
4. 針對一條被干擾的基因，你們建議訂購幾個干擾載體？
針對一條被干擾的基因，我們建議至少構建3個干擾載體。
5.我如何監控轉染效率？
您可以采用維真生物帶有GFP標記的shRNA載體直接地監控轉染效率。
6. 維真生物能夠利用來自其它公司的載體構建vector-based shRNA載體嗎？
可以，不過需要您提供給我們載體。
7. Vector-based shRNA的交付周期為多久？
交付周期為2-3周。
8. 使用病毒感染細胞的優勢是什么？
病毒介導的shRNA可以克服一些由于靶細胞影響RNAi的問題，如原代細胞、成纖維細胞和樹突狀細胞等，這些細胞的轉染效率低。
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